NGS(二代测序)已经成为中国肿瘤临床医生常用的检测工具，中国临床肿瘤学会(Chinese Society of Clinical Oncology ，CSCO)肿瘤生物标志物专家委员会发布的第1个 NGS 临床应用调研显示，大于 30%的肿瘤 科医生每月 NGS 检测量超5个。在所有的NGS报告中，阴性报告往往被患者认为是“白做检测”、“没有意义”，那么，在临床中，阴性报告真的代表了没有任何变异吗？


2021年发布的《二代测序临床报告解读指引》（以下简称《指引》）中，对于“阴性报告”给出了如下的定义：即一份样本未能检出任何肿瘤体细胞突变 。《指引》指出面对阴性报告需要从送检样本和NGS panel两方面来考虑。
1、送检样本DNA总提取量和/或肿瘤占比

“送检样本是肿瘤组织、外周血循环游离DNA(circulating free DNA，cfDNA)或其他;结合样本质控信息及患者治疗史，综合判断样本中是否含有足够肿瘤成分，DNA 总提取量和/或肿瘤占比是否可能低于 NGS 的 LOD”——《二代测序临床报告解读指引》

思路迪医学检验所，年检测样本＞60000份，每一份样本上机前都会经历严格的7道质量控制标准，未达到质控标准的样本全部退检或重新送样。有效避免了因为样本DNA总提取量和/或肿瘤占比低于NGS的LoD而引起的阴性报告的可能性。

“选择的NGS panel(尤其是仅包含数个至数 十个基因热点区域的小panel)是否与患者的肿瘤类型相匹配，即该肿瘤常见变异是否能被该panel覆盖。比如一份血检全阴报告，采用panel针对泛癌设计、覆盖上百基因的热点区域，对目标癌种常见变异的覆盖度>90%，此时的全阴，很可能仅提示肿瘤全身负荷较低或其他原因(如患者正接受有效的抗肿瘤治疗)导致释放入血的循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)含量极低、未达检测平台的LOD。这种“全阴”不能反映肿瘤基因组变异状态，仅能提示“基因突变状态未知”。当然，这种血检全阴报告可以提供突变谱以外的其他信息，在特定场景下提示一定的预测、预后价值。”——《二代测序临床报告解读指引》

当检测报告全阴性时，思路迪有严谨的追溯与复审流程，以此来排除因为技术等原因造成的“假阴性”。以晚期NSCLC为例，晚期NSCLC驱动基因变异AF低至0.14%[1]，由此可见，panel基因覆盖的广度（基因数）和测序深度，对于低频突变的检出率起到至关重要的作用。
思路迪OK伴侣产品，实现所有外显子全长覆盖，采用高密度叠瓦式设计，每个区域至少2层探针覆盖，两端外延60bp，确保外显子的3/5端完全覆盖，双重保证无漏检。血检采用35000×饱和式测序，与10000×相比可多检出36%的ctDNA低频突变位点，其中，37%与用药、耐药及预后相关。
那么，除了《指引》中指出的从送检样本和NGS pane两方面来考虑阴性报告外，突变类型和假阳性也是我们需要关注的问题。
3、临床意义不明变异(vous)常被误认为“阴性报告”

图. 变异的分类——ACMG标准和指南
在报告呈现中，有致病性变异(MUT)和可能致病性变异(VLM)是最直观的阳性报告，尤其是驱动基因的MUT和VLM，常适配有相应的靶向药/免疫药。但若发现没有以上两种变异类型的结果，也不要着急下阴性报告的结论，还有一种变异类型也不容忽视，那就是——临床意义不明变异（VOUS），这类变异是指现有的研究未能阐述该变异的功能影响或临床意义，后续的科学研究发展，可能提供证据说明这类变异的临床意义；此外，这些缺乏证据的临床意义未明变异，也可能成为临床科研转化的方向。
思路迪在报告撰写方面，除了参考ACMG标准和指南外，同时会使用自建数据库，自建数据库相比公共数据库在数据注释方面更加全面和准确 。
4、真阳性vs假阳性？

有些临床NGS报告中会报出数页突变频率低于1%、甚至是低于0.1%的低频变异，这些变异到底是真阳性？还是测序过程中引入的错误呢？
这里就不得不再重申LoD的概念，LoD是指在该检测下限重复20次检测其中19次都能稳定检出相同的变异，例如思路迪的OK伴侣LoD达到0.1%，则突变频率>0.1%的变异，我们都能稳定检出、确认为真阳性。
但重复20次仅能偶尔检出几次的低频变异，不能被认为“稳定检出”，这样的变异则不能被用于指导临床治疗决策。
思路迪Super-Seq技术采用35000×饱和式测序，与10000×相比可多检出36%的ctDNA低频突变位点，其中，37%与用药、耐药及预后相关，且使用三重降噪技术，实现真正的LoD为0.1%，检测结果真正实现又全又准，稳定可靠。

图. 思路迪Super-Seq技术
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参考文献
[1] Ann Oncol, 2019, Apr 1,30(4):597-603.

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